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HPLC法测定4种细辛中马兜铃酸Ⅰ和细辛脂素

归档日期:07-16       文本归类:细辛      文章编辑:爱尚语录

  August2014 V01.36 No.8 HPLC法测定4种细辛中马兜铃酸I和细辛脂素 (1.西北工业大学生命学院,陕西西安710072;2.西北濒危药材资源开发国家工程实验室,陕西师范大学生命科学学院,陕西西安710062) 摘要:目的 采用HPLc法测定华细辛、铜钱细辛、毛细辛和辽细辛不同部位马兜铃酸I和细辛脂素的量。方法 分析在MERcK c。s色谱柱(250 mm4.6 mm,5斗m)上实施;流动相为乙腈旬.05%磷酸水,梯度洗脱;体积流量为 1.o mL/min,检测波长为260 nm,柱温30。结果 马兜铃酸I和细辛脂素的线斗mL(r=o.999 7),其平均回收率分别为98.8%(RsD为1.1%)和99.8%(RsD为 o.7%)。结论4种细辛中均检测到马兜铃酸I,叶中含有量均大于根茎。细辛脂素在毛细辛茎中未检测到.细辛脂 素在华细辛和辽细辛根及茎中含有量较叶中高。 关键词:细辛;马兜铃酸I;细辛脂素;高效液相色谱 中图分类号:R284.1 文献标志码:A 文章编号:1001—1528(2014)08—17ll旬5 doi:10.3969/i.issn.1001—1528.2014.08.032 Determination aristolochicacid Iand asarinin fourspecies PfR办忽Dm以by HPLC SONG Shuang—hon91, SE Lin—ge2, CHEN Bei2, CUI Lang—jun2, SHANG Pen91 Res。Mrce眈口ef。pi愕旷EHd姗舻阳d吼iMse ABSTRACT:AIMTo use HPLC IIlethod quantitativelva11alvze arist010chie acid Iand asarinin diflferentparts 4s以rMmsie60fd五]iq.,4. de6ife FI.anch.,4. 矗im以f以icum Hook. etThoms,and 矗eferofropoi如sFr.Schmidt var.m以nds矗MricMm(Maxim.)Kitag.METHODS The analysis MERCKC1 R(250 mm4.6 mm,5斗m)column acetonitrile.water(0.05%H3POd)as mobile phase agradientelute man— ner. The wavelength 260nm. 1.0 mL/min ofow mte 30oC tempemture were adopted. RESULTS The standard cuIves aristolochicacid Iand asarinin showed good linearity 0.01~250g/mL(r=0.999 0.6mL~200mL(r=0.9997),respectively.Their recoveries were 98.8% (RSD= 1.1%)and 99.8% (RSD=0.7%,respectively. CONCLUSION Aristolochic acid Iexists meas—ured plants itscontent moI.ethan 矗im以f以icMmHook. etThoms does haveasarinin Fr.Schmidtvar. m以nds矗MricMm(Maxim.)Kitag have asarinin gI.eaterthan leaves.KEY WORDS:4s以ri acidI:asarinin:HPLC 细辛为马兜铃科植物北细辛4s以rMm厶e抛阳f阳一 poi如s Fr.Schmidt var. (Maxim.)Kitag.、汉城细辛4s以rMm Miq.var.sM—ze瑚e Nakai或华细辛4s以rMm s渤of捌Miq.的干燥根 及根茎u o。前两种习称“辽细辛”。夏季果熟期或 初秋采挖,除去地上部分和泥沙,阴干。细辛性温 味辛,具有祛风散寒、通窍止痛、止咳平喘、温肺 化阴等功效怛o。陕西省是细辛主产区,其原植物有 收稿日期:2013一09—24 基金项目:西安市科技计划项目(Ncl206[6]);陕西省自然科学基础研究项目(2叫4JQ3100) 作者简介:宋双红,女,博士生,研究方向:植物生物技术。E-mail:songshuanghon徊snnu.edu.cn *通信作者:商澎,男,教授,博士生导师。 1711 m阻Te鹄nhC万方数据 2014年8月 中成药Chinese Traditional Patent Medicine August 2014 V01.36 No.8 4种:华细辛4s以rMm Miq.、铜钱细辛4s以一rMm如6沈Fmnch.、 毛细辛4s以rMm矗im以勉记Mm Hook.F. et Thoms和双叶细辛4s以rMm c以Mfescens Maxim。由于目前中医习惯使用的辽细辛及华细 辛药源短缺,以致民问有把毛细辛和铜钱细辛作 为代用品使用的情况发生。2005年版及以前《中 国药典》仅以挥发油作为细辛药材质量控制指 标。《中国药典》2010年版中增加了马兜铃酸I 限量测定及细辛脂素的测定。因此本实验采用高 效液相色谱法,对华细辛、毛细辛、铜钱细辛及 辽细辛不同部位马兜铃酸I和细辛脂素进行了测 定和比较,为细辛药材的合理用药和质量控制提 供参考。 1仪器、试剂与材料 1.1主要仪器 高效液相色谱仪(shimadzu Lc一 2010A),超声波清洗器(KQ一600DB),液相色谱一 质谱联用仪(Agilentll00一Esquire 6000),MILLI—Q 超纯水仪,电子天平等。 1.2 实验试剂 对照品马兜铃酸I(批号 353O25》2 5OO5O789101l 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 ,/min A110746—200507),细辛脂素(批号111889—201001) 购自中国药品生物制品检定所,供含量测定用。乙 腈、甲醇为色谱纯,水为超纯水。 1.3 实验材料药材均采自陕西省宁强县黄坝驿 镇,由陕西师范大学生命科学学院植物分类研究室 田先华教授鉴定,分别为马兜铃科植物华细辛4s以一 rMm Miq.、铜钱细辛4s以rMm如砚eFmnch.、 毛细辛4s以rMm矗im以f以icMm Hook.F. et Thoms和辽 细辛4s以rMm矗eferofropoi如s Fr.Schmidt var.m以nds矗M— ricMm(MaXim.)Kitag.的干燥全草。样品保存于陕 西师范大学植物标本室。 2方法与结果 2.1 色谱条件 MERcK c,。色谱柱(250 mm 4.6 mm,5m);体积流量1.0 mL/min;柱温 30 oC;进样量10 uL;检测波长260 nm;以乙腈 (A)一0.05%磷酸水(B)为流动相,梯度洗脱 (0~20 min,30%—}45%A;20~30 min,45%A; 30~35 min,45%斗55%A;35~45 min,55%j 75%A),对照品及样品色谱图见图1。 25507510 O12 55O17 520 022 525 O,/min B1.马兜铃酸I 2.细辛脂素 1.arist010chic acid I2.asarinin 图1对照品(A)及细辛样品(B)HPLC图谱 HPLCchromatograms referencesubstances(A)and sample(B) 2.2对照品溶液的制备 精密称定马兜铃酸I对 照品2.34 mg,细辛脂素对照品1.95 mg,分别置 于10 mL量瓶中,用甲醇溶解并定容,超声处理 5min使样品溶解,待冷却后得对照品贮备液。 2.3 样品溶液的制备精密称定60 oC干燥至恒重 的细辛样品粉末0.63 g(过100目筛),置于 25 mL锥形瓶中,精确加入70%甲醇15 mL,称定 质量,密封,超声(500 W,40 kHz)处理45 min, 取出并冷却至室温,称定并补足损失的质量。进样 前摇匀,用0.22m滤膜过滤后作为供试品溶液。 2.4线”项制备的马兜铃 酸I贮备液,精确稀释至0.01、0.1、1、10、60、 1712 110、160、250斗mL,分别进样10斗L,以进样 质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲 线),结果表明马兜铃酸I在0.01~250 恤g/mL之问与峰面积呈良好的线性关系。 同样取细辛脂素贮备液,稀释至0.6、6、60、 90、120、150、200斗mL,分别进样10斗L,以 进样质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准 曲线),结果表明细辛脂素在0.6~200mL 之问与峰面积呈良好的线精密度试验分别取马兜铃酸I和细辛脂素 万方数据2014年8月 中成药Chinese Traditional Patent Medicine August 2014 V01.36 No.8 对照品溶液,照“2.1”项色谱条件重复进样5 次,每次10L,测得马兜铃酸I和细辛脂素峰面 积积分值的RsD分别为2.5%和0.9%,表明仪器 的精密度良好。 2.6重复性试验 取同一份细辛样品按“2.3” 项方法制备5份样品,连续进样,每次10L,测 马兜铃酸I和细辛脂素的峰面积积分值的RsD分 别为0.5%和0.6%,表明重复性良好。 2.7稳定性考察取同一份供试品溶液,分别于 配制后0、2、4、10 h进样,测定马兜铃酸I峰面 积RsD为2.6%,细辛脂素峰面积RsD为0.8%, 表明样品中马兜铃酸I和细辛脂素在10 h内稳定, 可以满足本方法测定时问上的要求。 2.8加样回收率试验精密称定已知含有量华细 辛根作为实验样品,分别准确加入对照品(马兜 160斗mL,细辛脂素120mL)0.25,0.5及1.0 mL,按“2.3”项方法制作供试品, 依“2.1”项色谱条件进行测定,分别计算马兜 收率‘15]。表】马兜铃酸I加样回收率实验结果 Tab.1 Results recoverytests aristolochicacid I表2细辛脂素加样回收率实验结果 Tab.2 Results recoverytests asarinin2.9样品测定分别取4种细辛不同部位样品, 按“2.3”项样品制备方法操作,得各供试品溶 液,按“2.1”项色谱方法测定,以外标法计算马 兜铃酸I和细辛脂素量,结果见表3。 表3样品测定结果(n=3) Tab.3 Content aristolochicacid Iand asarinin dif_ferent samples(尼=3) 品名 华细辛 毛细辛 铜钱细辛 辽细辛 马兜铃酸I/(g 3.112.42 2.72 1.75 27.35 1.59 3.62 —4.28 —20.36 —1.95 —4.34 O.51 73.16 —1.23 2.66 8.14 1.85 16.61 1.56 3质谱鉴定 样品中马兜铃酸I和细辛酯素的量都比较低, 本实验在采用对照品验证的基础上,又通过液相色 谱一质谱联用技术,对两个标准化合物的相对分子 质量进行了验证,以确保结果的准确性。 3.1 质谱条件 ESI离子源,雾化气压为35 psi psi_6.895kPa),干燥气流量为11 mL/min, 干燥温度为350 oC,质谱扫描质量范围为50~ 500。采用全扫描一级质谱和选择离子扫描二级质 谱两种方式同时测定。色谱条件同“2.1”项。 3.2质谱检测结果马兜铃酸I(相对分子质量 341.27,结构式见图2,质谱图见图3) 离子m龙340,碎片离子m几分别为340、324、293;细辛脂素(相对分子质量354.35,结构式见 图4,质谱图见图5)[M—H]一离子m尼353,碎片 离子m几分别为353、339、310。 图2马兜铃酸I结构式 Fig.2 Structure aristolochicacid I4讨论 4.1 马兜铃酸又名增噬力酸或木通甲素,在马兜 铃属植物中普遍存在并且在个别的几种中含有量较 大。近年来,国内外发现并报道了不少因服用过量 含马兜铃酸的中草药而导致肾衰竭的病例,引起国 内外的广泛关注_3 J。《中国药典》2005年版起,已 削一根茎叶根茎叶根茎叶根茎叶 万方数据 2014年8月 中成药Chinese Traditional Patent Medicine August 2014 V01.36 No.8 33 89图3马兜铃酸I质谱图 MSchromatogram aristolochicacid IIntens 图4细辛脂素结构式Fig.4 Structure 3529图5细辛脂素质谱图 MSchromatogram asarinin不再收录广防己、关木通、青木香等含有马兜铃酸 的中药方,并使用其他品种替代。此外,对其他含 马兜铃酸生药的药用部位也进行了更改。如《中 国药典》2000年版以前细辛的药用部位均为“全 草”,但后来考虑到细辛地上部分马兜铃酸含有量 较高,且古代中医一直仅使用根部, 《日本药局 方》也仅用“根和根茎”,所以《中国药典》2005 年起将药用部位修订为根和根茎。 《中国药典》 2010年版进一步对细辛中马兜铃酸I进行限量测 J。多年来对于细辛中是否含有马兜铃酸I,1714 马兜铃酸I含有量多少及其肾毒性的文献报道不 一,有文献报道细辛药材中不含有马兜铃酸I_4 也有文献报道马兜铃酸在华细辛、北细辛、单叶细辛中含有量甚微,只有关木通、广防己、青木香所 含马兜铃酸的0.15%~4.8%口o。因此需要对不同 种细辛中马兜铃酸进行定量测定,为安全用药提供 参考。 4.2细辛脂素也广泛存在于马兜铃科的植物中, 是细辛中的非挥发性成分,具有抗病毒和抗结核杆 菌的作用帕J。有文献报道细辛脂素对免疫有抑制 性作用,能够产生保护受体器官的作用o 7I。近年 来对细辛中细辛脂素的定量测定鲜有报道。《中国 药典》2010年版将细辛脂素作为细辛药材的质量 控制指标之一。因此有必要建立并测定细辛中细辛 脂素的量,为细辛药材质量控制和开发利用提供科 学依据。 4.3本实验提取溶剂及提取方法的选择以华细辛 为研究对象,分别比较了甲醇、70%甲醇和乙醇为 提取溶剂,超声和热回流的提取效果。结果4种溶 剂的提取率无显著差异,超声提取的效果优于回流 提取,且快速省时,故采用70%甲醇为溶剂,超 声提取45 min。 4.4色谱条件的选择和优化参照文献M J,比较了 流动相甲醇一磷酸水、乙腈一磷酸水系统,结果乙腈一 磷酸水分离效果较佳,故采用乙腈一磷酸水系统为 流动相。细辛脂素在287 nm波长下吸光值较高, 但在260 nm波长下马兜铃酸和细辛脂素均具有较 高灵敏度p o,因此检测波长选用260 nm。该法可 以同时检测两种待测成分,且达到基线分离,符合 定量测定的要求…。 4.5 《中国药典》2010年版对马兜铃酸I进行了 限量,依高效液相色谱法测定,按干燥品计算,马 兜铃酸I的含有量不得过0.001%。而细辛脂素作 为细辛的指标成分之一,按干燥品计算,含细辛脂 素不得少于0.050%_l J。本实验检测结果,根和茎 中马兜铃酸I的量都低于《中国药典》2010年版 规定标准,叶中含有量较高,故以根及根茎入药是 比较安全的。细辛脂素在华细辛和辽细辛根、茎、 叶中均检测到,但在毛细辛中未检测出,铜钱细辛 除茎外,也未测出细辛脂素。可见不同种细辛中马 兜铃酸I和细辛脂素的量差别较大,且同一种细辛 地上部分和地下部分马兜铃酸I的量亦有较大差 别,提示用药上应合理取材。有文献分析比较同一 产地华细辛、毛细辛和铜钱细辛的挥发性成分。结 万方数据 2014年8月 August2014 V01.36 No.8 果3种细辛挥发性成分在数量和含有量上各有差 异,此外3种细辛均含有独特的挥发性成分[11。13]。 全面评价药材质量需综合多种挥发性成分及非挥发 性成分u 4I。从临床用药安全考虑,建议厂家应对 细辛药材进行用药部位筛选和马兜铃酸的限量检 查,既要保证药效,又要保证毒性成分的用量在允 许范围内。 参考文献 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2叫0年版一部[s].北京:中国医药科技出版社,2叫o:214. 朱跃兰,侯秀娟,赵凤毛.细辛应用安全性的研究进展 [J].中华中医药学刊,2叫o,28(6):1175—1177. 中华医学会.临床诊疗指南一肾脏病学分册[s].北京:人 民卫生出版社,2叫1:167—169. 黄顺旺.北细辛中不含马兜铃酸的薄层色谱法鉴别[J].安 徽医药,2003,7(4):299 张萍,冉海林,肖新,等.细辛类植物中马兜铃酸A 的定性及定量分析[J].药物分析杂志,2006,26(6): 811—814. 蔡少青,王禾,陈世忠.北细辛非挥发性化学成分的研 究[J].北京大学学报:医学版,1996,28(3):228. 张丽丽,关振中,张景奎.细辛脂素体外免疫抑制作用的 实验研究[J].中华心血管杂志,2003,31(6):444. 王桂芳,张守尧,朱素琴.HPLc法测定北细辛中芝麻脂 素和细辛脂素的含量[J].药物分析杂志,1999,20 (4):251. 高钧,孙爽,李德坤,等.高效液相色谱法测定华细 辛不同部位马兜铃酸A含量[J].药物分析杂志,2006, 26(3):401403. 郝旭亮,倪艳,李先荣.HPLc测定不同产地和品种细辛 药材中马兜铃酸的含量[J].中成药,2006,28(8): 1209—1210. 陈蓓,胡苏莹,李昆伟,等.三种细辛挥发性成分的比较 研究[J].中药材,2叫o,33(12):1886—1893. 法分析华细辛不同部位挥发性成分[J].中药材,2010,33(10):1582—1585. 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HPLC法测定不同产地竹叶柴胡中柴胡皂苷a、d (贵阳中医学院,贵州贵阳550002)摘要:目的 建立HPLc法同时测定竹叶柴胡中柴胡皂苷a和d并对不同产地的品种进行比较。方法 Agilent c、。色谱 柱(150 mm4.6 mm,5斗m);流动相为乙腈一水;检测波长204 n“;柱温40;体积流量1.o mL/min;进样量 10斗L。结果竹叶柴胡中柴胡皂苷a、d的进样量分别在O.147~4.41斗g(r=O.999 9)、O.091~2.73仙g(r= 0.999 7)范围内与峰面积呈良好线性关系,加样回收率分别为101.6%(RsD为2.9%)、100.4%(RsD为2.3%)。 结论对10个产地竹叶柴胡中柴胡皂苷a的平均含有量为o.12%,柴胡皂苷d为o.07%,其中以云南禄丰产的含有 量最高。 关键词:竹叶柴胡;柴胡皂苷a;柴胡皂苷d;高效液相色谱法 中图分类号:R284.1 文献标志码:A 文章编号:1001—1528(2014)08—1715旬4 doi:10.3969/i.issn.1001—1528.2014.08.033 Determination saikosideaand saikoside fromdif_ ferent growing areas HPLC收稿日期:2叫3—10一12 基金项目:贵州省科学技术厅“贵州省中药、民族药炮制技术研究平台建设”(黔科合社字[2009]5001号) 作者简介:王建科(1966),男,高级实验师,主要从事中药炮制研究。Tel:(0851)5652239,E-mail:奶k一66@163.com 1715 出阻Te鹄nhC]]]]]]]]o,州圳蜊例川吲I]]12345I[[万方数据

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